豬瘟（Classical Swine Fever, CSF, 或Hog Cholera, HC）首次于1810年發(fā)生在美國中西部和南部地區(qū)，是世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）要求報告的豬病，曾在全球范圍內主要養(yǎng)豬國家流行，導致重大經濟損失。目前主要出現(xiàn)在中南美洲、歐洲、亞洲和部分非洲地區(qū)（Sandra et al., 2017; Liani et al., 2021）。隨著上個世紀50年代我國C株豬瘟活疫苗研發(fā)成功和不斷改進，以及優(yōu)化臨床運用以后，我國豬群豬瘟臨床發(fā)病率已大幅下降。為更好的利用豬瘟疫苗控制豬瘟，本文將討論疫苗保護水平、感染和免疫現(xiàn)狀，影響免疫效果的常見因素，以及在目前的生產和疾病流行狀態(tài)下，如何進一步優(yōu)化豬瘟免疫程序。
1 豬瘟疫苗及C株疫苗免疫保護優(yōu)勢
目前應用的豬瘟活疫苗主要來自中國的C株、日本的GPE-株、法國的Thiverval株、墨西哥的PAV-250株和菲律賓的Coronel株等，C株活疫苗是目前使用最廣泛的活疫苗（Hongliang et al., 2018; Fangfang et al., 2022）。
全病毒C株活疫苗雖然被國內外廣泛使用，但其免疫后誘導豬體產生的抗體和野毒感染后產生的抗體無法區(qū)分，加上過去偽狂犬病凈化項目中成功運用標記疫苗和鑒別ELISA的經驗，許多研究者致力于標記疫苗的研究（Marker vaccines，也稱DIVA vaccines, DIVA是“the serological differentiation between infected and vaccinated animals”的縮寫），以期用來配合豬瘟凈化。標記疫苗有嵌合體活疫苗（如碩騰的Suvaxyn®CSF Marker、韓國的FLC-LOM-BErns）和缺失特定表位的活疫苗，載體疫苗，以及E2亞單位疫苗等。E2亞單位疫苗有桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)（如TWJ-E2®）和植物表達系統(tǒng)表達的疫苗，以及自動組裝的納米疫苗等（Yuyin et al., 2020；Fangfang, et al., 2022）。
E2亞單位疫苗因為能夠作為標記疫苗，引起了廣泛的研究。研究證明E2亞單位疫苗（Porcilis® Pesti, 梅里亞公司產品，德國生產）安全、可提供臨床保護和預防豬瘟病毒傳播，但免疫保護力產生較晚，疫苗免疫后達到完全預防水平傳播能力需要14天，特別是在早期保護和阻止通過胎盤感染方面存在缺陷，免疫母豬時，其后代存在持續(xù)感染的風險（Depner et al., 2001；Oirschot et al., 2003；Sandra et al.，2017；EMA, 2019；Dewulf et al., 2004）。為進一步提高E2亞單位疫苗的免疫效力，有研究人員在佐劑、抗原組合、抗原遞呈系統(tǒng)方面進行了新探索（Park et al., 2020）。
我國目前主要使用的C株活疫苗是通過兔體或細胞傳代的致弱活疫苗，至少具有5個顯著優(yōu)勢：
1）遺傳穩(wěn)定，安全。免疫后無排毒，不返強（至少30代），疫苗毒在組織中緩慢而有限的復制（Liani et al., 2021）。
2）產生免疫保護力快。疫苗免疫后不到1天就有半數的豬只產生部分保護，3天就能足夠預防直接接觸傳播和很大程度地迅速減少感染，5天能得到完全保護（Simon et al., 2012）。稍早的研究甚至發(fā)現(xiàn)，用C株活疫苗免疫當天攻毒都能預防病毒傳播（Dewulf et al., 2004）。
3）免疫保護完整。成功免疫后可提供完整的臨床保護和清除性免疫，能阻斷母豬妊娠期通過胎盤感染胎兒而引起的后代持續(xù)性感染（Liani et al., 2021)。
4）交叉保護廣。無論對哪種基因型的豬瘟野毒都能提供100%的臨床保護，具有廣泛的交叉保護力(Fangfang et al., 2022)。
5）免疫保護期長。成功免疫后誘導的保護力長達6~12個月，甚至終生（Hongliang et al., 2018；Liani et al., 2021）。
2 豬瘟感染和免疫現(xiàn)狀調查
2.1 感染現(xiàn)狀調查結果
近年來，我國豬群的豬瘟發(fā)生率已經大幅度下降，根據中國獸醫(yī)簡訊的通報，2010~2014年的豬瘟病例發(fā)生分別為476、268、115、28和28例，2017年僅21例（Zhou, 2019）。碩騰（北京）診斷實驗室對2021年5月至2023年4月期間來自全國30個省份的299個豬場的1171個樣本用熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）檢測了豬瘟病毒核酸，結果陽性場和陽性樣本比例分別為6.35%和2.22%，具體各類樣本檢測結果如表2-1。
表2-1 qPCR檢測2021.5~2023.4期間各類樣本CSFV核酸陽性匯總
2.2 豬瘟疫苗免疫程序和豬瘟ELISA抗體調查結果
為進一步了解目前豬群臨床實際運用豬瘟疫苗的程序及其效果，碩騰（北京）檢測實驗室對2021年5月至2023年4月期間送檢的各階段樣本基本完整、數量基本符合要求的，來自30個省202個豬場的豬瘟疫苗免疫程序進行了分析。結果顯示（圖2-1和圖2-2），目前母豬群普遍采用“一刀切”的方式免疫豬瘟疫苗，2~4次/年免疫的豬場占到95%；生長豬群則普遍采用兩針免疫豬瘟疫苗，約占76%；也有23.8%的生長豬群免疫一針豬瘟疫苗；個別生長豬群采用三針免疫豬瘟疫苗。在一針免疫豬瘟疫苗的生長豬群中，21~28日齡、30~43日齡、55~63日齡免疫的比例分別為8%、9.4%、6.4%。
圖2-1 202個場母豬群采用的免疫程序占比
圖2-2 202個場生長豬群采用的各免疫程序占比
盡管目前商品化的ELISA豬瘟抗體檢測試劑盒不能鑒別診斷野毒感染產生的抗體和疫苗免疫后產生的抗體，但由2.1的調查結果可知道，目前絕大部分的豬場已不存在豬瘟感染。在這種情況下，我們認為，運用商品化的ELISA豬瘟抗體檢測試劑盒對豬群豬瘟抗體進行評估能夠反映豬瘟疫苗接種后免疫反應的情況。據供應商提供的信息，本實驗室所用豬瘟ELISA試劑盒的檢測結果判讀標準為：阻斷率（Blocking%）≥40%，為陽性；阻斷率<40%，為陰性；該ELISA試劑盒檢測血清抗體值（阻斷率）與中和抗體滴度呈強相關。于是本實驗室對這202個豬場各生產階段的16913份血清樣本用商品化的ELISA豬瘟抗體試劑盒進行了檢測，并用盒須圖分析了不同免疫程序的母豬群和采用兩針及21-28日齡、30-43日齡、55-63日齡等三類一針免疫程序的生長豬群各生產階段的豬瘟抗體陽性率和樣本的豬瘟抗體值（圖2-3~圖2-12）。
圖2-3 202個場采用各免疫程序母豬群豬瘟抗體陽性率盒須圖
圖2-4 202個場采用各免疫程序母豬樣本豬瘟抗體值盒須圖
經對圖2-3和圖2-4分析，對現(xiàn)階段母豬群的豬瘟疫苗免疫效果初步分析如下：1）調查的母豬群中豬瘟抗體陽性率最低可達50%以下，但無論采用哪種免疫程序，下四分位的母豬群的豬瘟抗體陽性率也在90%以上；2）采用各種免疫程序母豬群樣本中，下四分位的樣本的豬瘟抗體值（阻斷率）都在70%以上。這些數據基本說明，目前絕大多數的母豬群免疫程序效果很好，少數母豬群抗體陽性率不理想，這可能和后備母豬豬瘟抗體陽性率相對較低有關。
圖2-5 采用兩針免疫方案的152個場生長豬群各生產階段豬瘟抗體陽性率盒須圖
圖2-6 采用兩針免疫方案的152個場生長豬群各生產階段樣本豬瘟抗體值盒須圖
圖2-7 采用21-28日齡一針免疫方案的16個場生長豬群各生產階段豬瘟抗體陽性率盒須圖
圖2-8 采用21-28日齡一針免疫方案的16個場生長豬群各生產階段樣本豬瘟抗體值盒須圖
圖2-9 采用30-43日齡一針免疫方案的19個場生長豬群各生產階段豬瘟抗體陽性率盒須圖
圖2-10 采用30-43日齡一針免疫方案的19個場生長豬群各生產階段樣本豬瘟抗體值盒須圖
圖2-11 采用55-63日齡一針免疫方案的13個場生長豬群各生產階段豬瘟抗體陽性率盒須圖
圖2-12 采用55-63日齡一針免疫方案的13個場生長豬群各生產階段樣本豬瘟抗體值盒須圖
基于上圖2-5~12結果，我們對于目前生長豬群的母源抗體保護和不同免疫程序的臨床反應進行總結，可得到下面幾個初步的結論：
1）生長豬群如果不接種豬瘟疫苗，仍有75%豬群在6周齡時抗體陽性率在85%以上，平均阻斷率在57%以上，說明多數生長豬群母源抗體的保護至少可持續(xù)6周；
2）6周齡之前免疫，多數豬群沒有改變抗體陽性率下降的趨勢，會促進陽性率的箱體加大（豬群間陽性率差異加大），這種趨勢越早免疫越明顯；
3）單針免疫時間在8周齡以后，免疫反應普遍較快，但12周齡左右箱體較大，可能與有些豬群存在影響免疫反應的因素有關；
4）只有30-43日齡和55-63日齡免疫一針的75%以上豬群在16周齡以后陽性率在70%以上；在達到這個陽性率水平之前的12周齡和14周齡，30-43日齡免疫一針的豬群陽性率箱體更窄，豬群間陽性率差異更小，可能與這個時間段接種疫苗后受豬群其他影響因素有關。兩針免疫的豬群總體上也沒有達到這個水平。
5）無論兩針，還是一針免疫的生長豬群，總有少數生長豬群在10~20周齡陽性率較低，但免疫一針的豬群出現(xiàn)的可能性更小。
3 免疫效果不理想主要原因探討
許多因素會影響豬瘟疫苗免疫效果，常見的有：豬瘟病毒持續(xù)感染狀態(tài)、母源抗體、年齡、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）和其他病原、豬只自身健康狀況、疫苗質量、疫苗冷鏈和保存、接種技術等。
3.1 持續(xù)感染的影響
研究證明，豬瘟病毒，特別是中低毒力的豬瘟病毒，在母豬妊娠中期通過胎盤感染胎兒和仔豬21日齡之前（尤其在出生后前幾個小時）感染，會引起仔豬的持續(xù)感染，是導致地方性流行的重要因素。這種持續(xù)性感染引起“遲發(fā)型”豬瘟，感染的仔豬臨床健康，但胸腺嚴重萎縮，血清中病毒滴度高，長時間帶毒、散毒，無可見細胞免疫和體液免疫反應，經C株疫苗免疫后，也無ELISA特異性抗體和中和抗體反應及特異性γ干擾素分泌細胞（Specific IFN-γ producing cells）數量增多等現(xiàn)象，在血清和扁桃體中也無C株疫苗毒（Liani et al., 2019; Sara et al., 2015a,b）。
3.2 母源抗體的干擾
研究發(fā)現(xiàn)，5周齡仔豬血清中母源中和抗體滴度在64時，影響了用C株豬瘟疫苗免疫后的細胞免疫反應和體液免疫反應，免疫13天后攻毒仍無可見中和抗體反應，特異性γ干擾素分泌細胞數量也無顯著上升，攻毒后有50%的豬會發(fā)熱和能分離到豬瘟病毒，四分之一會發(fā)生白細胞減少現(xiàn)象；但是，血清中母源中和抗體滴度在32及以下的仔豬接種C株豬瘟疫苗以后13天內特異性γ干擾素分泌細胞數量顯著上升，免疫13天后攻毒，仔豬得到完全保護，無發(fā)熱、白細胞減少現(xiàn)象，也沒有分離到豬瘟病毒，血清中和抗體也顯著上升（Sanipa et al., 2003）。其他類似的研究也表明，血清母源中和抗體滴度在32及以下時能成功免疫C株疫苗，大于32時免疫會影響疫苗的效果（Kim et al., 1984；Suvintarakorn et al., 1993）。
3.3 年齡影響
研究發(fā)現(xiàn)，血清中母源中和抗體滴度都在16以下時，5周齡相對3周齡仔豬，接種C株豬瘟疫苗以后的體液免疫反應和細胞免疫反應差別明顯。5周齡仔豬接種疫苗后兩周血清中和抗體顯著上升，而3周齡仔豬接種疫苗后十周內血清中和抗體仍呈下降趨勢；在10周齡時，5周齡免疫的仔豬的特異性γ干擾素分泌細胞數量極顯著高于3周齡免疫的仔豬（Mongkol et al., 2002）。其他研究也發(fā)現(xiàn)，在7-56日齡之間，免疫日齡越大，免疫后有免疫反應豬的比例越高（Carranza et al., 2007）。
3.4 疾病的影響
我國學者首先報道豬瘟疫苗免疫前2天感染PRRSV會影響豬瘟疫苗抗體反應，特別是免疫后3-5周的抗體反應顯著較低（Hua et al., 2003）。其后有學者在免疫豬瘟疫苗前一周感染PRRSV，免疫3周后再用CSFV野毒攻毒來評估在免疫豬瘟疫苗前一周感染PRRSV對豬瘟免疫保護的影響，結果發(fā)現(xiàn)提前一周感染PRRSV的豬瘟免疫豬攻毒后在臨床、病毒學和病理學特征上都與未免疫豬瘟疫苗組相似。于是得出結論，PRRSV急性感染期接種豬瘟疫苗會導致免疫失敗（Suradhat et al., 2006）。但是，近期有報道稱，豬瘟疫苗和PRRSV疫苗同時接種能誘導強的特異性的體液和細胞免疫反應（Liu et al., 2023）。
我國臺灣學者研究了提前感染2型豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus type 2, PCV2）對豬瘟疫苗免疫效果的影響，他們在接種PCV2后12天接種豬瘟疫苗，然后再于疫苗接種后15天用豬瘟野毒攻毒。結果發(fā)現(xiàn)，PCV2抑制了CSF特異性免疫細胞增殖反應、短暫推遲了中和抗體反應，導致了臨床保護不完全，攻毒后部分豬發(fā)熱、出現(xiàn)病毒血癥和排毒等問題（Huang et al., 2011）。
我國學者進一步研究了豬細小病毒（Porcine parvovirus, PPV）、偽狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）和PRRSV在接種C株疫苗前一周單獨感染及混合感染對豬瘟疫苗免疫效果的影響。他們在免疫C株疫苗前一周先讓試驗豬單獨感染PPV、PRV、PRRSV和混合感染這3種病毒，接種疫苗后6天再用豬瘟石門強毒株攻毒，評估攻毒后的臨床表現(xiàn)和豬瘟帶毒情況。結果證明，所有接種了豬瘟疫苗的試驗豬都沒有出現(xiàn)任何癥狀，但是在豬瘟疫苗免疫前單獨感染這3種病毒或這3種病毒同時感染的豬攻毒后絕大部分成為攜帶CSFV豬，而免疫豬瘟疫苗前沒有感染這3種病毒的豬得到了完全保護，沒有成為豬瘟帶毒豬（Ning et al., 2011）。
3.5 疫苗和接種技術
目前在我國豬群使用的豬瘟疫苗有C株豬瘟活疫苗和E2亞單位疫苗，C株豬瘟活疫苗因為病毒培養(yǎng)方式和來源不同，有兔體培養(yǎng)的組織苗（乳兔組織苗和脾淋組織苗）和各種細胞培養(yǎng)的細胞苗（如原代細胞苗和ST細胞苗、SK細胞苗、BT細胞苗等傳代細胞苗）。如1所述，C株豬瘟活疫苗和豬瘟E2亞單位疫苗各有優(yōu)缺點，在免疫保護產生的時間、保護程度方面，C株豬瘟活疫苗被廣泛認可，具有絕對優(yōu)勢；但豬瘟E2亞單位疫苗作為DIVA疫苗，其誘導的抗體和野毒感染后產生的抗體能夠被目前的ELISA抗體檢測試劑盒區(qū)分開。
另外，國外有豬瘟C株疫苗免疫后不是所有的豬都得到完全意義上保護的報道（Terpstra et al., 1988; Ilona et al., 2010），這種現(xiàn)象普遍被認為與研究者使用的C株疫苗毒株與我國C株有差異有關。目前生產疫苗時所用的不同的細胞系是否對C株疫苗種毒的穩(wěn)定性、抗原性有影響，需要進一步研究。
一般認為，疫苗的質量、效價會影響疫苗免疫效果，抗原質量高、含量穩(wěn)定、精確定量的疫苗是臨床穩(wěn)定免疫效果的前提。碩騰在國內上市的豬瘟C株疫苗具有額外特點：1）BT傳代細胞培養(yǎng)C株豬瘟疫苗毒抗原遺傳性能更穩(wěn)定；2）疫苗中病毒數量定量準確。疫苗中豬瘟病毒數量用免疫熒光方法對病毒半數感染量進行精確定量（50% fluorescent antibody infectious dose, FAID50），每頭份病毒含量應≥104.0FAID50，相對用兔體感染量（RID）和病毒培養(yǎng)液的數量更為準確；3）先進的生產工藝控制使疫苗抗原質量和穩(wěn)定性更優(yōu)秀。
其他與疫苗有關的直接影響最終疫苗接種效果的因素還包括：疫苗不恰當的冷鏈運輸、儲存以及疫苗接種技術等。
4 瑞溫安®免疫程序推薦
免疫程序的制定往往基于疫苗本身及其免疫保護特點、疾病流行規(guī)律和壓力以及影響免疫效果的因素而定。
考慮到豬瘟免疫保護特點、豬瘟持續(xù)性感染產生的原因及豬瘟免疫效果調查結果（見2.2），建議瑞溫安®后備種豬和種豬群參考如下免疫程序：后備母豬：配種前完成2次加強免疫，間隔1個月，每次1頭份；公豬和母豬群：每年2-3次，每次1頭份。
上文3.4提到在免疫豬瘟疫苗前感染PPRSV、PRV、PPV會損害豬瘟疫苗效果，考慮到PRV、PPV在絕大多數陽性豬場都是在10周齡以后循環(huán)，目前的生長豬群免疫程序主要平衡母源抗體的影響和PRRSV循環(huán)時間的影響：
1）在保育期無PRRSV活躍的豬群?？山Y合接種疫苗前某個時間點的血清中母源中和抗體水平和母源抗體衰減規(guī)律而確定初步接種時間。例如，采集沒有接種豬瘟疫苗的4周齡仔豬血樣30份，檢測中和抗體值，考慮到母源抗體半衰期取平均值11天（Achariya et al., 約2周；Joris et al., 2001, 7.9天）和母源中和抗體32及以下不會干擾免疫反應，可初步得出合適的免疫時間：（log24周齡時采樣樣本的上四分位中和抗體值-log232）×11+28。也就是如果4周齡采樣樣本的上四分位中和抗體值為256，則初步免疫時間為：（log2256-log232）×11+28=61日齡。如果沒有條件檢測中和抗體，也可通過用與中和抗體相關性高的ELISA抗體試劑盒檢測ELISA抗體來推導對應的粗略中和抗體值來計算免疫日齡（Alfonso et al., 2001；Li et al., 2013；Wang et al., 2020）。
2）如果保育期像目前多數豬場一樣，PRRSV在6周齡以后循環(huán)，可以在至少PRRSV循環(huán)前一周完成瑞溫安®的免疫，即5-8周齡免疫（多數豬群是母源中和抗體最低的時候，Li et al., 2020）。
3）如果PRRSV循環(huán)較早，早于6周齡，建議采取措施穩(wěn)定母豬群PRRSV早期排毒的同時，豬瘟免疫建議錯開PRRSV感染急性期，也可以在5-8周齡免疫，只是建議免疫后4-6周要采樣評估是否需要再次免疫。所以，對于目前絕大多數豬場瑞溫安®可以在5-8周齡免疫，圖2-9~12的結果也證明了這點。另外，如果發(fā)生豬瘟病例，可以用該疫苗進行緊急免疫（Dewulf et al., 2004）。
5 總結
本實驗室通過最近兩年對299個豬場的1171個樣本qPCR檢測豬瘟病毒核酸，以及202個豬場豬瘟免疫程序及其抗體反應結果的調查，可以發(fā)現(xiàn)：一方面，目前豬瘟感染率已經很低，但仍有豬群存在；另一方面，目前的豬瘟免疫程序大多數豬群基本達到要求，但也存在一些豬群的免疫后抗體表現(xiàn)不理想。因為運用免疫原性優(yōu)秀的C株種毒，結合BT傳代細胞培養(yǎng)、FAID50抗原含量評估，以及先進穩(wěn)定的生產工藝，瑞溫安®的抗原含量更精確、免疫原性更穩(wěn)定。鑒于我們上文不同豬群免疫程序的抗體反應分析結果，后備種豬應在配種前完成兩次加強免疫，間隔1個月；種豬群每年接種2~3次。生長豬群制定免疫程序時可結合對PRRSV、PRV、PPV在豬群循環(huán)的時間的認識和母源中和抗體的衰減規(guī)律，大多數生長豬群可在5~8周齡接種瑞溫安®一次；對于PRRSV在保育期或更早循環(huán)的生長豬群，建議5~8周齡免疫瑞溫安®6周后檢測評估，如有必要，可以加強免疫一次；對于保育期無PRRSV循環(huán)的豬群根據中和抗體評估結果，可推遲至更晚時間免疫瑞溫安®。
